Étude de MutS à l'échelle de la molécule unique
Résumé
Using single molecule micromanipulation and force measurement on DNA with a magnetic tweezer setup, this work has been devoted in part to a study of the " long patch " repair system of DNA. This repair involves the MutS, MutH and MutL proteins, and uses an as yet unidentified mechanism in order to act at a distance, between a site of mismatch (due for example to a replication error), and a proximal GATC hemimethylation
site, so that the repair is directed toward the newly synthesized strand. Some models of this action at a distance, involve the presence of a DNA loop, induced by the action of MutS on a mismatch. We have tried to explore this possibility, by studying the mechanical behavior of a long double stranded DNA, containing (or not containing) a mismatch. We have not detected any specific loop formation in DNA, i.e. only induced when a mismatch is present. This negative result seems to exclude specific loop formation induced by MutS. In a second part, we have studied the mechanical behavior of a Holliday junction (a cross-shaped DNA, involved as an intermediate during recombination). We have shown directly that it is possible to extrude a Holliday junction, by mechanically undercoiling a palindromic DNA. We have deduced the pitch of the DNA double helix from the behavior of the Holliday junction. In a last part, we have studied the influence of Ethidium Bromide, on DNA. We have shown that this intercalating agent is able to induce a non-specific attraction either intra-strand or inter-strand, in single-stranded DNA.
site, so that the repair is directed toward the newly synthesized strand. Some models of this action at a distance, involve the presence of a DNA loop, induced by the action of MutS on a mismatch. We have tried to explore this possibility, by studying the mechanical behavior of a long double stranded DNA, containing (or not containing) a mismatch. We have not detected any specific loop formation in DNA, i.e. only induced when a mismatch is present. This negative result seems to exclude specific loop formation induced by MutS. In a second part, we have studied the mechanical behavior of a Holliday junction (a cross-shaped DNA, involved as an intermediate during recombination). We have shown directly that it is possible to extrude a Holliday junction, by mechanically undercoiling a palindromic DNA. We have deduced the pitch of the DNA double helix from the behavior of the Holliday junction. In a last part, we have studied the influence of Ethidium Bromide, on DNA. We have shown that this intercalating agent is able to induce a non-specific attraction either intra-strand or inter-strand, in single-stranded DNA.
Par micromanipulation et mesure de force sur molécule unique, avec un piège magnétique, ce travail a porté en partie sur l'étude du système de réparation « à longue distance » de l'ADN. Cette réparation fait intervenir pour son initiation les protéines MutS, MutL, et MutH et utilise un mécanisme non identifié précisément, qui lui permet
d'agir à distance, entre un site de mésappariement de l'ADN (dû par exemple à une erreur de réplication), et un site proximal distant (hémi-méthylation de séquence GATC), ce qui permet de diriger la réparation sur le brin néosynthétisé. Certains modèles de l'action de la protéine MutS font intervenir une boucle dans l'ADN. Nous
avons cherché à mettre en évidence une telle action sur un ADN double brin, contenant (ou ne contenant pas) un mésappariement. Nous n'avons pas mis en évidence de
formation de boucle par MutS, qui soit spécifiquement liée à la présence d'un mésappariement. Ce résultat négatif semble donc exclure ce modèle de boucle spécifique. Dans une deuxième partie, nous avons effectué des expériences de micromanipulation sur une jonction de Holliday (ADN en forme de croix, intermédiaire de recombinaison). Nous avons montré directement qu'il est possible d'extruder une jonction de Holliday, en sous-enroulant mécaniquement une molécule d'ADN comportant une séquence palindromique, et avons aussi déduit de ces expériences une mesure du pas de l'hélice de l'ADN. Dans une dernière partie, nous avons étudié l'influence du bromure d'éthidium sur l'ADN. Nous avons montré que la présence de cet agent intercalant peut induire une attraction non-spécifique, intra- ou inter- simple brins d'ADN.
d'agir à distance, entre un site de mésappariement de l'ADN (dû par exemple à une erreur de réplication), et un site proximal distant (hémi-méthylation de séquence GATC), ce qui permet de diriger la réparation sur le brin néosynthétisé. Certains modèles de l'action de la protéine MutS font intervenir une boucle dans l'ADN. Nous
avons cherché à mettre en évidence une telle action sur un ADN double brin, contenant (ou ne contenant pas) un mésappariement. Nous n'avons pas mis en évidence de
formation de boucle par MutS, qui soit spécifiquement liée à la présence d'un mésappariement. Ce résultat négatif semble donc exclure ce modèle de boucle spécifique. Dans une deuxième partie, nous avons effectué des expériences de micromanipulation sur une jonction de Holliday (ADN en forme de croix, intermédiaire de recombinaison). Nous avons montré directement qu'il est possible d'extruder une jonction de Holliday, en sous-enroulant mécaniquement une molécule d'ADN comportant une séquence palindromique, et avons aussi déduit de ces expériences une mesure du pas de l'hélice de l'ADN. Dans une dernière partie, nous avons étudié l'influence du bromure d'éthidium sur l'ADN. Nous avons montré que la présence de cet agent intercalant peut induire une attraction non-spécifique, intra- ou inter- simple brins d'ADN.
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